Производство муконовой кислоты из глюкозы и ксилозы у Pseudomonas putida посредством эволюции и метаболической инженерии

Nature Communications, том 13, номер статьи: 4925 (2022) Цитировать эту статью

8047 Доступов

8 цитат

24 Альтметрика

Подробности о метриках

Муконовая кислота представляет собой биопривилегированную молекулу, которую можно превратить в химические вещества, которые напрямую заменяют существующие нефтехимические продукты, и биопродукты с улучшенными эксплуатационными характеристиками. В этом исследовании Pseudomonas putida KT2440 был разработан для преобразования глюкозы и ксилозы, основных углеводов в лигноцеллюлозных гидролизатах, в муконовую кислоту с использованием стратегии, основанной на модели, для максимизации теоретического выхода. Используя адаптивную лабораторную эволюцию (ALE) и метаболическую инженерию в штамме, сконструированном для экспрессии пути D-ксилозоизомеразы, мы демонстрируем, что мутации в гетерологичном симпортере D-ксилозы:H+ (XylE) увеличивают экспрессию главного переносчика суперсемейства фасилитаторов (PP_2569). ), а также сверхэкспрессия aroB, кодирующего нативную 3-дегидрохинатсинтазу, обеспечивает эффективное производство муконовой кислоты из глюкозы и ксилозы одновременно. Используя рационально сконструированный штамм, мы производим 33,7 г л-1 муконата при расходе 0,18 г л-1 ч-1 и молярном выходе 46% (92% от максимального теоретического выхода). Эта инженерная стратегия перспективна для производства других соединений, полученных шикиматным путем, из лигноцеллюлозных сахаров.

Развитие экономических процессов производства биотоплива и биохимических продуктов из лигноцеллюлозы будет иметь решающее значение для сокращения антропогенных выбросов парниковых газов, связанных с потреблением ископаемого топлива1,2. Среди различных областей метаболического пространства, которые были исследованы для биохимического производства, молекулы микробных ароматических катаболических путей демонстрируют значительное химическое разнообразие3,4. Следует отметить, что цис,цис-муконовая кислота (далее муконат) является популярным химическим веществом катаболического пути катехолов, которое может быть получено из ароматических соединений лигнина, углеводов и ароматических соединений, полученных из пластика5,6,7,8,9. ,10,11,12. Муконат представляет собой биопривилегированную молекулу13, которую можно преобразовать либо в химические вещества прямой замены, такие как адипиновая кислота и терефталевая кислота5,14,15, либо в биопродукты с улучшенными эксплуатационными характеристиками16,17,18,19,20,21,22,23,24 .

Производство муконата из углеводов основано на шикиматном пути биосинтеза ароматических аминокислот и впервые было продемонстрировано на рекомбинантной Escherichia coli5. Эритрозо-4-фосфат (E4P) и фосфоенолпируват (PEP) конденсируются с образованием 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфата (DAHP), который далее превращается в 3-дегидрошикимат (3-DHS), ключевое промежуточное соединение в шикиматный путь. Из 3-DHS сообщалось по крайней мере о пяти путях биосинтеза муконата25,26,27,28,29,30. Среди этих путей один проходит через промежуточный протокатехоат (PCA) через 3-DHS дегидратазу (asbF) и приводит к более высокому максимальному теоретическому выходу, чем другие, которые проходят через шикимат через шикиматдегидрогеназу (aroE) (рис. 1a). )29.

Схема общей стратегии метаболической инженерии. Для использования ксилозы были гетерологично экспрессированы ксилоза, d-ксилозоизомераза (xylA), ксилулокиназа (xylB), трансальдолаза (tal) и транскетолаза (tkt) из E. coli. E4P и PEP конденсировались с образованием DAHP посредством устойчивой к обратной связи DAHP-синтазы (aroGD146N)70. Чтобы превратить DAHP в муконат (МА), гены, кодирующие 3-DHS-дегидратазу (asbF) из Bacillus cereus, а также декарбоксилазу PCA (aroY) и соответствующий белок, генерирующий ее кофактор (ecdB), оба из Enterobacter cloacae, были гетерологичны. выразился. aroB и катехол-1,2-диоксигеназа (catA) были сверхэкспрессированы3,32. Сконструированная хоризматпируватлиаза из E. coli (ubiC-C22)40 была сверхэкспрессирована для превращения хоризмата (CSA) в 4-гидроксибензоат (4HB), который может быть преобразован в PCA и MA. Удаленные гены показаны красным.Глюкозодегидрогеназа (гкд) была удалена, чтобы предотвратить образование ксилоната или глюконата. Глюкозо-6-фосфат-изомеразы pgi-1 и pgi-2 были удалены ранее3,32, но в этом исследовании pgi-1 был восстановлен. Пируваткиназы pykA и pykF были удалены, чтобы уменьшить конкуренцию за PEP. Для накопления МА pcaHG и catBC были удалены, чтобы предотвратить раскрытие кольца PCA и катаболизм МА соответственно. P фосфат, 2-KGn 2-кетоглюконат, 2-KG-6-P 2-кетоглюконат-6-P, G6P глюкоза-6-P, 6PG 6-фосфоглюконат, KDPG 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат, G3P глицеральдегид-3-P, FBP фруктоза-1,6-P2, F6P фруктоза-6-P, S7P седогептулоза-7-P, R5P рибоза-5-P, Ri5P рибулоза-5-P, 3PG 3-фосфоглицерат, CAT катехол, шикимат SA, шикимат-3-фосфат S3P, изоцитрат ICIT, цитрат CIT, альфа-кетоглутарат AKG, сукцинат SUCC, фумарат FUM, малат MAL, глиоксилат GLX, оксалоацетат OAA, ацетил-коэнзим A AcCoA. b Метаболическое моделирование максимума теоретические молярные выходы муконата и углерода с pgi-1 или без него. Синие линии представляют путь asbF, красные линии представляют путь aroE, сплошные линии представляют собой % молярного выхода, а пунктирные линии представляют % выхода углерода. Серые области представляют собой молярный процент потребленной ксилозы от 33 до 40% (с балансом глюкозы), имитируя состав гидролизатов кукурузной соломы. c Культивирование штамма QP328 на глюкозе и ксилозе в шейкерной колбе. Молярный выход в % рассчитывали как [мМ муконата/мМ (глюкоза + ксилоза) × 100], а выход углерода в % рассчитывали как [мМ муконата × 6/мМ (глюкоза × 6 + ксилоза × 5) × 100]. Столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение биологических троек. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

For shake flask and growth curve experiments, seed cultures were inoculated from glycerol stocks into 14-mL round bottom Falcon® tubes containing 5 mL of LB Miller medium and incubated overnight at 30 °C and 225 rpm. Overnight cultures were then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 10 mL LB medium to an initial OD600 of 0.2. These second seed cultures were cultivated at 30 °C at 225 rpm for 4 h to reach an OD600 of ~2. The second seed cultures were washed twice with M9 salts (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl) and then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 25 mL modified M9 minimal medium (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl, 2 mM MgSO4, 100 µM CaCl2, 18 µM FeSO4) supplemented with either 30 mM xylose, 30 mM glucose, or mixture of 30 mM glucose and 15 mM xylose, to an initial OD600 of 0.1. The molar ratio of glucose and xylose in mixed substrates is 2:1, which is the ratio typical of corn stover hydrolysates10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3149"56. All growth curves were characterized on Bioscreen C Pro analyzers (Growth Curves US) using 300-µL cultures inoculated as described for the shake flasks above. Shake flasks and plate reader data were plotted and analyzed using GraphPad Prism version 8.4.2. Absolute growth rate (μA) and growth lag (λ) were calculated based on Gompertz equation using default settings of the FittR tool deposited in GitHub (https://github.com/scott-saunders/growth_curve_fitting)57. In some cases, death phase was removed from the growth curve to fit the model./p>

Cells were inoculated in 0.5 L bioreactors (BioStat-Q Plus, Sartorius Stedim Biotech) at an initial OD600 of 0.2. The batch phase consisted of growth on 300 mL of modified M9 with 10.6 g L−1 glucose and 4.4 g L−1 xylose, which mimics the sugar ratio in sugar hydrolysates from corn stover10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3452"56. The fed-batch phase was initiated when the sugar concentration was approximately 7 g L−1, at which point sugars were fed to maintain sugar concentrations between ~2–10 g L−1 by manually modifying feeding rates. The feeding solution contained 353 g L−1 glucose and 147 g L−1 of xylose, and its pH was adjusted to pH 7 with NaOH. The bioreactors were controlled at pH 7 by the addition of 4 N NH4OH, at 30 °C, and air was sparged at 1 vvm. The initial agitation speed in the batch phase was 350 rpm. When the dissolved oxygen (DO) reached a value of 30%, it was automatically controlled at that level by automatic agitation adjustments. Samples were taken periodically to evaluate bacterial growth and to analyze sugar concentrations and muconate./p>10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)./p>